模板DNA(50 ng/μL)1 μL,上下游引物各1 μL,2×Power Taq PCR Master Mix(北京百泰克生物技术有限公司)5 μL,ddH2O 2 μL。用Bio-Rad 公司T100TMThermal Cycler进行PCR扩增,PCR反应条件为:95℃预变性3 min;然后变性30 s,50~60℃退火30 s(Touchdown),72℃延伸90 s,10个循环;然后变性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸90 s,25个循环;最后72℃延伸10 min。扩增产物经由8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,定压105 V电泳3.5 h,使用0.2%的硝酸银溶液银染2 min,去离子水洗涤2次,用3%的NaOH溶液显色,然后用Tanon Gis-2010型凝胶成像系统照相观察记录分析扩增产物的片段大小。
2 结果与分析
2.1 主要农艺性状
对小麦-长穗偃麦草种质材料进行基本的田间性状调查,结果(表3)表明,在株高方面,除L20160947株高为131.68 cm,略高于中国春(127.78 cm)外,其他材料株高在105.22~127.50 cm之间,均低于中国春。在穗长方面,除L20160941的6.66 cm和L20160943的6.80 cm,其余材料的穗均比中国春(6.82 cm)长,长度在7.38~9.92 cm之間。除L20160943、L20160947、L20161459、L20161461、L20161462的小穗数少于中国春外,其余材料小穗数分布于23.20~27.20个,均多于中国春。穗粒数高于中国春的有13份,在49.40~78.40之间;低于中国春的有3份,穗粒数分布在43.20~45.20。千粒重高于中国春(29.83 g)的有10份,在30.00~46.84 g;低于中国春的有6份,在27.47~29.56 g。但是L20160947的千粒重相对于中国春有较大的变化,增幅高达57.02%,达到极显著水平(图1A),而且其粒长和粒宽均优于中国春(图1B),抽穗期和开花期均早于中国春。
2.2 芽期耐盐性鉴定
用350 nmol/mL NaCl(2.0%)溶液对小麦-长穗偃麦草种质材料芽期耐盐性进行初步鉴定,结果(表4)显示,耐盐材料7份,占供试材料的43.75%;中耐材料5份,占供试材料的31.25%;敏感材料4份,占供试材料的25.00%;无高耐和高感材料。
对7份耐盐材料用2.2% NaCl溶液进一步筛选,仅得到1份耐盐性高于中国春的材料,表现为敏感型,占供试材料的14.29%;其余6份材料与中国春同属于高感材料,占供试材料的85.71%(表5)。
2.3 细胞学分析与原位杂交
为明确种质材料的遗传组成,首先对16份小麦-长穗偃麦草后代种质材料种子根尖有丝分裂中期细胞进行细胞学观察、统计,然后进行基因组原位杂交(GISH)。L20161461、L20161462的染色体条数为44条,且有2条外源染色体;L20160940、L20160942、L20161457、L20161459四份材料的染色体条数均为42条,且有2条外源染色体(图2)。
2.4 分子标记
经细胞学和原位杂交分析确定小麦-长穗偃麦草后代种质系材料中有4份异代换系和2份异附加系。为进一步确认外源染色体所属的同源群,用长穗偃麦草特异分子标记,对这6份材料进行鉴定,PCR扩增产物电泳图如图3所示。CSM-1E-1标记在L20161457中能扩增出目的条带,证明L20161457为1E/1D的异代换系;CSM-3E-5标记在L20161459中能扩增出目的条带,证明L20161459为3E/3B的异代换系;CSM-4E-1标记在L20160940和L20160942中能扩增出目的条带,证明L20160940和L20160942为4E/4D的异代换系;CSM-6E-2标记在L20161461中能扩增出目的条带,证明L20161461附加一对6E染色体;CSM-7E-1标记在L20161462中能扩增出目的条带,证明L20161462附加一对7E染色体。
3 讨论与结论
通过远缘杂交的方法将外源遗传物质转入到小麦遗传背景后,除了从外部性状的变化来判断外源遗传物质进入小麦外,还要及时了解外源遗传物质进入的多少、有利遗传物质的存在情况,对外源遗传物质(目的基因或染色体片段)进行跟踪鉴定,提高育种效率。目前,检测小麦外源遗传物质的方法主要有形态学、原位杂交和分子生物学方法等[17]。
本研究综合利用原位杂交与分子标记技术对16份小麦-长穗偃麦草种质系的染色体遗传组成进行鉴定,准确鉴定出2份异附加系和4份异代换系。其中L20161461、L20161462两份材料是二体附加系,分别附加6E和7E染色体,与引进时附加的外源染色体相一致;L20160940、L20160942、L20161457、L20161459为二体代换系,分别是DS4E(4D)、DS4E(4D)、DS1E(1D)、DS3E(3B)。L20160940的原引进外源染色体是3E,而经鉴定是4E代换系,鉴定结果与来源染色体不匹配,可能是在繁育过程中种子混收导致;另3份材料的外源染色体与引进时一致,其它材料没有检测到外源染色体或染色体片段的存在。
在小麦近缘物种耐盐性鉴定方面,Omielan等[18]认为长穗偃麦草3E染色体携有耐盐相关基因,而本研究中L20160941(来源3E)的耐盐性高于中国春,可能携有耐盐相关基因,与其研究结果一致。但二体代换系L20161459(3E/3B)耐盐性却低于中国春,可能有两个原因,一是3E染色体上携带的耐盐基因的功能是通过降低叶片钠离子含量增强小麦苗期或成株期的耐盐性[18,19];二是L20161459是二体代换系,虽然携有耐盐基因,但3E染色体上携有的其它基因影响了耐盐基因的表达。本研究综合利用原位杂交与分子标记技术鉴定此套种质材料,不仅明确了其染色体组成,也为充分利用长穗偃麦草优异基因进一步创制小麦新种质材料奠定基础。
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